ריצוף DNA

מתוך ויקיפדיה, האנציקלופדיה החופשית

ריצוף DNA הוא תהליך של קביעת סדר הנוקלאוטידים בקטע DNA נתון, כלומר, מציאת רצף ה-DNA. בגלל חשיבותו של תהליך הריצוף, פותחו שיטות לריצוף מהיר של מקטעים ארוכים. עדיין, שיטת הריצוף השכיחה ביותר, ואשר באמצעותה נקבעו מרבית הרצפים הגנטיים הידועיים כיום מאפשרת קריאה של מקטעים קצרים יחסית, בד"כ פחות מ-1000 בסיסים (נוקלאוטידים). ריצוף מקטעים ארוכים יותר נעשה על ידי חיתוך ה-DNA למקטעים קצרים וחופפים, ריצוף של כל אחד מהם בנפרד, והרכבת הרצף הארוך על פי הקטעים החופפים.

חלק מג'ל עם מקטעי DNA מסומנים
הגדל
חלק מג'ל עם מקטעי DNA מסומנים

[עריכה] ריצוף בשיטת Sanger

שיטת ריצוף ה-DNA הנפוצה ביותר היא שיטת Sanger שפותחה ע"י פרדריק סנגר בשנת 1975. על פיתוח השיטה והשימוש בה, זכה סנגר בפרס נובל שני בכימיה בשנת 1980. בשיטה זו משתמשים בפריימרים (תחלים) המתאימים לרצף DNA הצמוד לקטע אותו רוצים לרצף, ובאנזים דנ"א-פולימראז, המשמש להארכת הפריימר (תחל) ליצירת רצף משלים לקטע ה-DNA. בנוסף, יש לספק לתגובה האנזימטית גם dNTPs מארבעת הסוגים (A, T, C ו-G). מבצעים 4 תגובות מקבילות שלכל אחת מהן מספקים גם ddNTP אחד (C, T, A או G) בו יש פוספט גם בעמדה '2 בנוסף לעמדה '3. שילוב של ddNTP ברצף ה-DNA המסונתז במבחנה יביא לעצירת הפולימריזציה. כך, מתקבלים מגוון רצפים שנקטעו באורכים שונים.

הרצת תוצרי התגובות האנזימטיות בגל אגרוז בעל יכולת הפרדה של נוקלאוטיד אחד מספקת את הרצף. בכל מבחנה יהיו תוצרים שאורכם הוא המרחק מהתחל ועד הבסיס/הנוקלאוטיד המסויים שהוסף לאותה תגובה בתור ddNTP. כיום נהוג להישתמש במערכות אוטומטיות וב-ddNTPs פלואורסנטיים. מערכות אלה יכולות להשתמש ב-4 חומרים פלואורסנטיים שונים, דבר המאפשר הרצת כל הריאקציות על אותו גל והפרדה בין ה-ddNTPs השונים על פי הפלואורסנציה שלהם.

שפות אחרות