אלקטרופורזה

מתוך ויקיפדיה, האנציקלופדיה החופשית

התוצאה המתקבלת לאחר הרצת תערובות באלקטרופורזה. התמונה מראה צילום נגטיבי של התוצאות; בצורה זו מנתחים בדרך-כלל את התוצאות, ולא ישירות על הג'ל
הגדל
התוצאה המתקבלת לאחר הרצת תערובות באלקטרופורזה. התמונה מראה צילום נגטיבי של התוצאות; בצורה זו מנתחים בדרך-כלל את התוצאות, ולא ישירות על הג'ל
תוצאות אלקטרופורזה צבועות בקומאסי כחול, צבע המשמש לצביעת חלבונים
הגדל
תוצאות אלקטרופורזה צבועות בקומאסי כחול, צבע המשמש לצביעת חלבונים
שלבי הרצת תערובת באלקטרופורזה
הגדל
שלבי הרצת תערובת באלקטרופורזה

אלקטרופורזה (Electrophoresis) היא שיטה בכימיה אנליטית ובביולוגיה מולקולרית המאפשרת הפרדת חומרים המצויים בתערובת. זוהי אחת השיטות המדעיות הנפוצות בכימיה ובביולוגיה.

באלקטרופורזה מונחת התערובת (מומסת בנוזל או נוזלית בעצמה) על גבי משטח העשוי ג'ל. זרם חשמלי מועבר דרך הג'ל, כך שצידו האחד טעון חיובית והשני - שלילית. המולקולות בתערובת, אשר טעונות חשמלית, נודדות באיטיות לעבר קצהו האחד של הג'ל, כשהן נשמעות לכוח המשיכה החשמלית.

המולקולות בתערובת אינן נודדות בקצב זהה. מולקולות כבדות יותר נודדות באיטיות, ואילו מולקולות קלות נודדות במהירות ומגיעות רחוק יותר בג'ל. גם אם לשתי מולקולות שונות משקל זהה, הרי שצורתן המרחבית משפיעה אף היא על קצב הנדידה. כך מושגת הפרדת התערובת למרכיביה.

עקרון פעולת האלקטרופורזה מזכיר את זה של הכרומטוגרפיה, אף היא שיטה אנליטית נפוצה. ההבדל ביניהן הוא שבכרומטוגרפיה לא נעשה שימוש בחשמל; התערובת נודדת הודות לכוחות כימיים (מים המטפסים ספונטנית במעלה הנייר בכרומטוגרפיית נייר, למשל) או עקב הפעלת לחץ (ב-HPLC, כרומטוגרפיית נוזל בלחץ גבוה). באלקטרופורזה מניעה המשיכה החשמלית את המולקולות באופן בלעדי.

השימוש הנפוץ ביותר של האלקטרופורזה הוא בביולוגיה, ובמיוחד בביוכימיה, בביולוגיה מולקולרית ובגנטיקה. חלבונים וגדילי DNA ו-RNA מתאימים מאוד להפרדה באלקטרופורזה, וזוהי השיטה העיקרית להפרדתם. ליתר דיוק, משמשת האלקטרופורזה בעיקר למטרות אנליטיות (זיהוי מרכיבי התערובת) ולא למטרת הפרדה, שכן ברוב המקרים המולקולות שאותן בודקים נהרסות בתהליך, ולא ניתן לאספן לשימוש נוסף.

SDS
הגדל
SDS

בהפרדת חלבונים עשוי הג'ל מפולימר אמידי הקרוי פוליאקרילאמיד. לפני הרצת התערובת בג'ל מוסיפים לה בדרך-כלל דטרגנט הנקרא SDS (סודיום דודציל סולפט); עתה מכונה השיטה באופן מלא SDS-PAGE, ראשי תיבות באנגלית של Sodium Dodecyl Sulfate - PolyacrylAmide Gel Electrophoresis. הדטרגנט נקשר לחלבון ביחס התואם לגודל החלבון - מולקולת SDS אחת נקשרת לכל שתי חומצות אמינו. ה-SDS טעון שלילית, וכך מגביר את יכולת הנדידה של החלבון בשדה החשמלי; רוב יכולת הנדידה מושגת למעשה באמצעות ה-SDS, ולא מסתמכת על המטען החשמלי של החלבון עצמו. בנוסף, גורם ה-SDS לשבירת קשרים בחלבון ולהרס המבנה השניוני והשלישוני שלו. לאחר טיפול ב-SDS כל החלבונים בתערובת הופכים ללינאריים (קוויים), כך שהפרדתם עתה מבוססת באופן מלא על גודלם (כלומר, על מספר חומצות האמינו המרכיבות אותם). ללא טיפול ב-SDS עלולים חלבונים בעלי גודל זהה לנדוד בצורה שונה; חלבונים כדוריים, למשל, עלולים להיתקע בחריצים הזעירים שבג'ל ולנדוד באיטיות. הטיפול ב-SDS מונע תופעה זו.

שני חומרים נוספים בהם משתמשים בדרך-כלל לפני הרצת תערובת חלבונים הינם DTT ויודואצטאמיד. הראשון מנתק קשרים דיסולפידיים (קשרי גופרית-גופרית בין שיירי ציסטאין בחלבונים), והשני מוסיף לשיירי הציסטאין החשופים קבוצת אצטיל (CH3CO) בכדי למנוע מהם מליצור קשרים דיסולפידיים מחדש. קשרים אלו תורמים רבות ליציבות החלבון ולצורתו התלת-ממדית; הטיפול בשני חומרים אלו תורם אף הוא, אם כן, לקבלת חלבונים קוויים, בעלי צורה אחידה.

בהפרדת חומצות גרעין עשוי הג'ל מאגרוז (Agarose), סוכר הדומה לאגר; כאן לא נעשה שימוש ב-SDS.

[עריכה] וריאציות של אלקטרופורזה

ב-1975 פותחה האלקטרופורזה הדו-ממדית, המשלבת מיקוד איזואלקטרי עם אלקטרופורזה. בשיטה זו, המדויקת בהרבה מכל אחת משתי השיטות כשמשתמשים בהן בנפרד, ציר ה-Y של הג'ל מבוסס על אלקטרופורזה, והשדה החשמלי משתנה לאורכו. ציר ה-X מבוסס על מיקוד איזואלקטרי, ודרגת החומציות (ה-pH) משתנה לאורכו. החלבונים מופרדים באופן כפול, לפי גודלם ולפי הנקודה האיזואלקטרית שלהם. בשיטה זו ניתן לבודד בהצלחה אלפי חלבונים על-גבי ג'ל אחד.

באלקטרופורזה בְנִים (Capillary) מתרחש כל התהליך בצינור גמיש, ארוך (עד 100 מטרים) ודק ביותר (קוטרו הפנימי פחות ממילימטר). התערובת מוזרקת בלחץ או תוך שימוש בוואקום אל הנים, אשר אינו מכיל ג'ל, כי אם מצופה בצידו הפנימי בסיליקה או בחומר דומה. התוצאות מפוענחות על-ידי גלאי ומוצגות באופן גרפי על-גבי צג או מודפסות על-גבי נייר. שיטה זו מהירה ומדויקת ביותר.

[עריכה] קישורים חיצוניים